
ANáLISIS DE IGA ESPECíFICA PARA HELICOBACTER PYLORI EN CALOSTRO DE MUJERES MEXICANAS
Klimov Kravtchenko Ksenia, Universidad de Guadalajara. Asesor: Dr. Leopoldo Santos Argumedo, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (IPN)
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Helicobacter pylori es una bacteria Gram negativa, microaerofílica. Habita el estómago, siendo parte de la microbiota natural de la mucosa gástrica, en más del 50% de la población mundial. Dicho microorganismo ha coexistido con los humanos durante miles de años. Sin embargo, desde 1994 está clasificado como carcinógeno de tipo 1, ya que la mayoría de cánceres gástricos y duodenales son ocasionados por H. pylori.
Países en vías de desarrollo, como México, presentan una seproprevalencia de H. pylori mayor, que países desarrollados. En un estudio por Torres et al., se analizaron 11,605 muestras de suero de pacientes mexicanos desconocidos, por medio de ELISA, de las cuales 7,720 (66%) eran seropositivos para H. pylori.
El calostro es la secreción inicial de las glándulas mamarias después del parto. Es una sustancia rica en inmunoglobulinas, de las cuales IgA es la más abundante, representando la mayor parte de la proteína en el calostro.
Debido a que en la mayoría de las poblaciones, el microorganismo es adquirido durante la niñez, el calostro podría proveer inmunidad pasiva ante H. pylori a los lactantes. En un estudio, se analizó el calostro de mujeres en Turquía, los resultados mostraron que el 60.2%, de las 161 muestras analizadas, que eran seropositivos para H. pylori, tenían IgA específica para H. pylori en su calostro.
No se ha realizado un análisis en México, que investigue la presencia de anticuerpos IgA anti- H. pylori en el calostro humano de mujeres lactantes. Este estudio sería de importancia, ya que gran parte de la población mexicana está infectada y la adquisición de la bacteria se da en la niñez.
METODOLOGÍA
Se realizó un ensayo ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas), siguiendo la metodología utilizada por Torres, J. et al, 1998, con modificaciones. Se utilizó una placa de 96 pozos, los cuales fueron sensibilizados con una mezcla de antígenos de células completas de 3 aislados de H. pylori de pacientes mexicanos, de los cuales 2 eran adultos y 1 niño. Se agregaron 0.5 mg/pozo del antígeno en solución amortiguadora de carbonatos (pH 9.6) y se incubó durante toda la noche a 4 ºC. En cada placa se realizo una curva de estándares con suero de pacientes positivos a H. pylori para establecer la concentración de anticuerpos. El bloqueo se realizó con BSA al 1% en PBS. Las muestras de calostro se diluyeron en 1:10 o 1:100 y se incubaron a 37 ºC durante una hora. Como anticuerpo secundario se utilizó anti-IgA1 o anti-IgA2 acoplados a biotina (anti-IgA1: anticuerpo monoclonal de ratón, Abcam®, Cat. Num. ab99796; 1:2500, anti-IgA2: anticuerpo monoclonal de ratón, Abcam®, Cat. Num. ab128731; 1:2000), se incubó durante 45 minutos a 37 ºC. Finalmente se incubó estreptavidina acoplada a peroxidasa de rábano picante (HRP) (Streptavidin HRP, Abcam®, Cat. Num. ab7403), durante 45 minutos a 37 ºC. Durante cada incubación se realizaron 5 lavados con PBST (pH 7.4). El sustrato utilizado fue TMB y se leyó a una absorbacia de 450 nm.
Para el Western-blot se realizaron geles de poliacrilamida al 10%, como antígeno se utilizó la misma mezcla de H. pylori. Por cada gel se agregaron 100 uL a concentración de 1 mg/ml. Se dejó correr durante 120 minutos a 80 V. La transferencia se hizo a una membrana de nitrocelulosa, durante 90 minutos a 100 V. Se realizó el bloqueo de las membranas con leche descremada al 5% en TBST. Se incubaron con calostro a dilución 1:1,000 durante toda la noche a 4ºC, en agitación. Posteriormente, se incubo con los mismos anticuerpos anti-IgA1 o anti-IgA2 acoplados biotina, a dilución 1:10,000 o 1:8,000 respectivamente, durante una hora, a temperatura ambiente, en agitación. Finalmente, se incubó con el mismo reactivo de estreptavidina-HRP diluido 1:10,000 durante dos horas, a temperatura ambiente en agitación. Entre cada incubación se realizaron 3 lavados con TBST (pH 7.6).
CONCLUSIONES
El calostro humano de mujeres mexicanas posee anticuerpos IgA específicos para Helicobacter pylori, de los cuales, el subtipo IgA1, encuentra en mayor proporción. La IgA1 presente en las muestras analizadas muestra mayor especificidad ante los antígenos de H. pylori. Las IgA1 reconocen diversos antígenos de H. pylori; se destaca la posible presencia de inmunoglobulinas específicas para ciertos factores de virulencia, como CagA y VacA.
Este estudio muestra la importancia del calostro humano como fuente de inmunidad pasiva ante la bacteria H. pylori, que está ampliamente distribuida en el país, y puede así mejorar la calidad de vida de los niños mexicanos.